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Proteinreinigung ist der Prozess des Übergangs von einer Mischung von Proteinen zu einem einzigen reinen Protein. Für die Erforschung von Protein Es ist notwendig, reines Protein zu erhalten. Das Ausgangsmaterial ist hauptsächlich ein Stoff oder mikrobiologische Kultur. Grob gesagt besteht die Proteinaufreinigung meist aus drei Phasen: Zellen, Trennen der Proteine ​​von den Nicht-Proteinen und dann Trennen des gewünschten Proteins von allen anderen Proteinen. Dieser letzte Schritt ist normalerweise der schwierigste.

Ziel

Das Ziel der Proteinreinigung kann präparativ oder analytisch in der Natur sein. Bei einer präparativen Aufreinigung ist das Ziel, so viel Protein wie möglich zu erhalten. Ein Beispiel dafür ist die "Produktion" von Insulin, das früher aus Schweinen gewonnen wurde (heute meist aus gentechnisch veränderten Bakterien). Bei einer analytischen Reinigung besteht das Ziel darin, eine bestimmte Proteinmenge zu gewinnen, um diese anschließend zu untersuchen (analysieren).

Vorbereitende Schritte

Es gibt eine große Vielfalt an Techniken zur Reinigung von Proteinen. Welches besser ist, lässt sich nicht sagen, denn das kann bei jedem Protein anders sein. Ein ständiges Problem bei der Proteinreinigung ist die Möglichkeit, Denaturierung. Die meisten Aufreinigungen zielen darauf ab, die biologische Konformation des Proteins zu erhalten. Da die physikalischen und chemischen Eigenschaften für jedes Protein unterschiedlich sind, gibt es keine universelle Technik.

Geben Sie das Protein frei eiwit

Um das Protein aus seiner Matrix (normalerweise eine Zelle, kann aber auch a Virus sind), ist der erste Schritt der Proteinreinigung. Häufig verwendete Techniken umfassen Beschallung und Lysozym (in Bakterien). Bei der Beschallung werden Ultraschallschwingungen in die Lösung geschickt, wodurch die Zelle zerfällt. Lysozym ist ein Enzym dass die Zellenwand durch Bakterien zerstört. Ein Nachteil von Lysozym ist, dass es auch ein Protein ist und das gewünschte Protein dann auch noch vom Lysozym abgetrennt werden muss.

Trennung des Proteinteils vom Nicht-Proteinteil

Anschließend muss der Proteinanteil vom Nichtproteinanteil getrennt werden. Dieser Nicht-Protein-Anteil enthält normalerweise Dinge wie DNA, RNA, Zellmembran, Zellenwand, Zellorganellen (wie Ribosomen, endoplasmatisches Retikulum usw). Diese Teile sind in der Regel schwerer und haben eine höhere Dichte als die Proteine ​​selbst. Dies wird dankbar genutzt: Der Proteinanteil kann vom Nichtproteinanteil getrennt werden mittels Zentrifuge. Der Nicht-Eiweiß-Anteil sinkt nach unten (der sogenannte Pellet) und der Proteinanteil bleibt in Lösung (de Überstand).

Löslichkeit

Bei der Proteinreinigung wird oft der Löslichkeitsunterschied, der zwischen verschiedenen Proteinen auftreten kann, dankbar genutzt. Eine Anzahl dieser Techniken wird unten beschrieben.

Fokussierung isoelektrisch

sehen Isoelektrische Fokussierung für den Hauptartikel zu diesem Thema.

Die isoelektrische Fokussierung, auch IEF genannt, basiert auf der Tatsache, dass Proteine ​​a isoelektrischer Punkt (Pi). Proteine ​​sind jederzeit in Lösung pH normalerweise geladen - entweder positiv oder negativ - durch Seitenketten, die als Säuren und Basen mit der Lösung wechselwirken können. Bei unterschiedlichen pH-Werten führen diese Säure-Base-Wechselwirkungen zu einem unterschiedlichen Protonierungsgrad und folglich zu einer unterschiedlichen Nettoladung des Proteins. Bei einem pH - dem pI des Proteins - gibt es gleich viele positive und negative Ladungen (zwitterion) und das Protein ist elektrisch neutral.

Die Technik kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Speziell für die analytische Trennung, a Elektrophorese auf einem Gel mit einem pH-Gradienten durchgeführt. Das Protein erfährt aufgrund seiner Ladung im elektrischen Feld eine Kraft und wandert durch das Gel. Wenn es einen Bereich erreicht, in dem der pH gleich dem pI ist, erfährt es keine Nettokraft im elektrischen Feld mehr und die Wanderung hört auf. Auf diese Weise werden Banden von Proteinen basierend auf dem isoelektrischen Punkt gebildet, die weiter analysiert werden können. Die meisten IEF-Gele haben einen pH-Bereich von 3 bis 9. Für die präparative Trennung wird diese Technik jedoch nicht weit verbreitet sein, da nur sehr geringe Proteinmengen durch Elektrophorese getrennt werden können. Bei einer präparativen Trennung wird man daher häufig isoelektrische Niederschlag. Dabei wird a. zur Proteinlösung gegeben Puffer hinzugefügt, damit die pH der Lösung entspricht dem pI des gewünschten Proteins. Wenn der pH-Wert der Lösung nicht dem pI entspricht, befinden sich die gleichen Proteine ​​im gleichen geladenen Zustand und stoßen sich gegenseitig ab. Jetzt, da der pH gleich pI ist, sind die Proteine ​​netto ungeladen und stoßen sich nicht mehr ab. Dadurch bilden sie Aggregate und lässt die zak fallen Löslichkeit dramatisch. Durch die Abnahme der Löslichkeit wird die Lösung übersättigt und es kommt zur Ausfällung. Der Nachteil dieser Technik besteht jedoch darin, dass viele Proteine ​​bei ihrem pI denaturieren und dies für die weitere Verwendung oder Analyse unerwünscht sein kann.

Thermische Denaturierung

Proteine ​​denaturieren zu einem bestimmten Zeitpunkt Temperatur. Wenn ein Protein denatiert ist, nimmt die Löslichkeit des Proteins stark ab. Dadurch fällt das Protein aus. Hat man nun eine Mischung von Proteinen, die bei unterschiedlichen Temperaturen denaturieren (und damit durchhängen), können die Proteine ​​getrennt werden. Angenommen, unser hypothetisches Protein A ist mit Protein B verunreinigt. A denaturiert bei 70 Grad, während B bereits bei 45 Grad denaturiert. Wird die Temperatur dann kurzzeitig auf 55 Grad gebracht, setzt sich das - unerwünschte - Protein B ab, während Protein A zurückgehalten wird.

Aussalzen

Beim Aussalzen wird die Löslichkeit des Proteins stark reduziert, indem die Ionenstärke durch Zugabe stark erhöht wird Salze. Wie bereits erwähnt, haben Proteine ​​in Lösung eine Ladung. Die Ionen der gelösten Salze schirmen diese Ladung ab. Auch der schützende Wassermantel um die Proteine ​​wird von den Salzen weggezogen. Dadurch sinkt die Löslichkeit der Proteine ​​so stark, dass Proteine ​​verklumpen und ausfallen.

Säulenchromatographie

Das Säulenchromatographie spielt eine wichtige Rolle bei der Proteinreinigung. Fast alle Reinigungen beinhalten irgendeine Form von Säulenchromatographie. Die Chromatographie ist eine Trennmethode, die darauf beruht, dass verschiedene Moleküle unterschiedlich an den sogenannten stationäre Phase - die Kolumne. Daher bewegt sich ein Molekül schneller durch die Säule als das andere Molekül; das Elutionszeit ist kürzer. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Säulen, die zu berücksichtigen sind, aber es gibt ungefähr drei Typen, die häufig bei Trennungen verwendet werden. Diese sind Gelfiltration, eine Form von Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie. Oft sind die Formen von HPLC, in der Biochemie auch FPLC oder Fast Protein Liquid Chromatography genannt.

Gelfiltration

Mit Gelfiltration - auch genannt Größenausschlusschromatographie genannt - die Säule besteht aus einem Gel bestehend aus porenbedeckten Granulaten. Die Moleküle der Mobile Phase fallen sozusagen in die Poren. Die Poren und Körner haben einen vorgeschriebenen Durchmesser. Größere Proteine ​​passen nicht in die Poren und nehmen daher den kürzesten Weg entlang der Körner. Die größten Proteine ​​landen somit im sogenannten Hohlraumvolumen und damit als zuerst eluieren. Je kleiner die Proteine ​​sind, desto häufiger fallen sie in die Poren und desto länger brauchen sie, um den Boden der Säule zu erreichen.

Ionenaustauschchromatographie

Die Ionenaustauschchromatographie (IEC) nutzt die Ladung von Proteinen, um eine Trennung zu erreichen. Die Spalte einer IEC ist stark Polar-. Es gibt zwei Arten von IEC; ein Kationenaustauscher (S-Typ) und a Anionenaustauscher (Q-Typ). Ein Kationenaustauscher selbst besteht aus negativ geladenen Sulfonsäurereste (-C₂-H₄-SO₃⁻). Ein Anionenaustauscher selbst besteht aus quartäre Ammoniumgruppen. (-C₂-H₄-Nein-(Äthyl)₃) Aufgrund des pI der Proteine ​​binden einige Proteine ​​stark an die Säule, andere nicht. Beispielsweise wird ein Protein mit einem hohen pI bei neutralem pH positiv geladen und bindet somit an eine S-Typ-Säule. Proteine ​​mit niedrigem pI werden in dieser Situation negativ geladen und werden sicherlich nicht an die Säule binden. Erhöht man nun langsam die Salzkonzentration, werden die Ladungen abgeschirmt und man kann genau bestimmen, wann das gewünschte Protein die Säule verlässt. So kann man eine Mischung von Proteinen trennen.