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ELISA ist ein Akronym für einen Labortest zu messen makromolekular Substanzen wie Proteine in Blutproben. Der Name ist eine Abkürzung von Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Ein anderer Begriff für ELISA ist Enzymimmunoassay (EIA).
ELISA ist eine immunchemische Reaktion und alle immunchemischen Assays basieren auf dem gleichen Prinzip, der spezifischen Bindung zwischen Antigen und Antikörper. Durch den Nachweis im Blut, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Menschen oder Tieres ist es möglich, zur Diagnose von a . beizutragen ansteckende Krankheit oder ein Autoimmunerkrankung.
Erkennung
Der Nachweis erfolgt durch Bindung der Proteine mit Antikörpern, die markiert sein. Dies bedeutet, dass sie chemisch verknüpft sein mit a Enzym wie Peroxidase die durch einen oder mehrere Zwischenschritte einen Farbstoff erzeugt. Je mehr von der nachzuweisenden Substanz vorhanden war, desto mehr Enzymaktivität wird gebunden und desto mehr Farbstoff entsteht letztendlich.
Protokoll
- Die Probe wird auf ein Substrat (Kunststoffplatte mit Proteinen adsorbiert)
- Es ist mit Protein blockiert (BSA) zu unspezifisch die Bindung der Antikörper verhindern.
Auftragen von Serum auf a Mikrotiterplatte für einen ELISA - Spüle die Platte mit Pufferlösung frei von ungebundener Probe
- Fügen Sie den Antikörper hinzu
- Waschen Sie die ungebundenen Antikörper weg
- Bei Verwendung von zwei Antikörpern:
- Spülen mit BSA (oder Kuhmilch) so dass unspezifisch Bindungen des zweiten Antikörpers werden viel unwahrscheinlicher
- Fügen Sie den zweiten Antikörper hinzu.
- Spülen Sie die Platte, damit ungebundene Antikörper verschwinden
- Fügen Sie eine Chemikalie hinzu (TMB), das mit dem gebundenen Enzym zu einem messbaren Reaktionsprodukt, beispielsweise einem Farbstoff, reagiert.
- Messen Sie die Konzentration des Reaktionsprodukts; dies ist dann ein Maß für die Menge der vorhandenen Proteine.
Variationen
Sie können auch zwei verschiedene verwenden Antikörper (Sekundärerkennung):
- Sandwich-ELISA: In die Wells wird ein unmarkierter Antikörper für die zu messende Substanz pipettiert.
- Indirekter ELISA: Ein markierter Antikörper gegen den konstanten Teil des ersten Antikörpers. ("Konstante" bezieht sich hier auf einen Abschnitt der "schweren Kette", der jedem Antikörper dieses Typs (z. B. IgG) gemeinsam ist.
Zum Beispiel kann der erste Antikörper von a . sein Hase bei denen eine Immunantwort gegen die gesuchte Substanz ausgelöst wird (durch BoosterImpfung mit dieser Substanz). Der zweite Antikörper stammt von einem anderen Tier (z. B. a Esel). Die Verwendung mehrerer Antikörper bietet erhebliche Vorteile:
- Signalverstärkung: Pro Erstantikörper können mehrere Zweitantikörper binden.
- Skalierung: Der zweite Antikörper muss nur für den Spender des ersten spezifisch sein, nicht so sehr gegen eine bestimmte Substanz, was die Produktion viel größer und billiger macht.
Kalibrierung
sehen Kalibrierung für den Hauptartikel zu diesem Thema.Zur Mengenbestimmung werden vorab Verdünnungen mit bekannten Konzentrationen der zu messenden Substanz sowie Verdünnungen der Probe vorgenommen. Da die Signalmenge proportional zur Enzymmenge ist, kann die Konzentration in der Probe bestimmt werden. Ein Beispiel ist der Dopingtest: Durch Konzentrationsmessung und Vergleich mit den erlaubten (natürlich vorhandenen) Konzentrationen wird ein Athlet auf Doping überprüft.
Bereitstellung
Wenn die Platte gefärbt ist, kann die Platte gelesen werden. Dies erfolgt mit einem ELISA-Reader auf Basis einer spektrophotometrischen Bestimmung. Diese Bestimmung verwendet zwei Wellenlängen, damit die Bestimmung genauer ist. Starke Färbungen haben bei höheren Wellenlängen keinen Einfluss, es gibt auch a PCR-ELISA-Test.
Siehe auch
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